Биологи сфотографировали процесс заражения клетки частицами ВИЧ
ВИЧ под микроскопом
В геном изучаемой клетки или вируса вставляются короткие последовательности нуклеотидов, заставляющие ее вставлять в некоторые белки “хвосты”-метки из четырех аминокислот. Они не мешают жизнедеятельности, но при этом служат “якорем” для молекул флуоресцентного вещества, которое вводится в клетку или в питательную среду перед экспериментом.
При наблюдении за клеткой PALM-микроскоп облучает ее короткими лазерными импульсами, которые включают и выключают случайное число молекул светящегося пигмента. Светочувствительные датчики фиксируют вылетевшие из клетки фотоны и специальный алгоритм “собирает” сверхчеткое изображение клетки по нескольким тысячам вспышек, которые были вызваны облучением лазера.
Ученые адаптировали эту методику для наблюдения за ВИЧ, добавив аминокислотные метки в молекулы интегразы – специального фермента, “вставляющего” ДНК вируса в хромосому его жертвы. Каждая вирусная частица содержит от 100 до 200 копий этого белка, что увеличивает шансы на обнаружение каждого вируса в момент заражения клетки.
Биологи подготовили раствор из частично собранных и полноценных частиц ВИЧ с вставленными аминокислотными метками и попытались рассмотреть их при помощи PALM-микроскопа. Методика оказалась вполне успешной – ученые смогли увидеть как небольшие шарики полусобранных вирусов диаметром в 50 нанометров, так и продолговатые конусы полных частиц ВИЧ длиной в 112 нанометров.
Первые результаты
Ученые приступили к наблюдению за частицами вируса в живой клетке. Для этого они вырастили небольшое количество помеченных “конусов” ВИЧ, заразили ими несколько иммунных клеток и наблюдали за этим процессом при помощи фотолокализующего микроскопа. За это время биологам удалось зафиксировать хронику заражения клетки и изучить этот процесс в динамике.
Как и ожидалось, большинство частиц ВИЧ было сконцентрировано в районе оболочки ядра клетки – основной цели молекул интегразы и всего вируса в целом. По расчетам биологов, им удалось достичь разрешения в 30 нанометров, что в несколько раз лучше, чем разрешение лучших оптических микроскопов.
Высокая разрешающая способность микроскопа позволила проверить, сбрасывает ли вирус свою защитную оболочку – капсид – сразу после проникновения в клетку или же только при прикреплении к ядру. Многочасовые наблюдения за состоянием вирусов показали, что вирус сохраняет капсид до тех пор, пока он не достигнет ядра своей жертвы.
Исследователи полагают, что их методика и результаты наблюдений помогут разработать эффективные методы борьбы с вирусом иммунодефицита человека и позволят лучше понимать процессы, протекающие внутри клеток.